増幅断片長多型法(Amplified fragment length polymorphism)

増幅断片長多型(AFLP)法は、特に有機体のゲノムまたは遺伝的特徴がほとんど知られていない場合、遺伝子型解析の効果的な手段となる。

Amplified fragment length polymorphism (AFLP) provides an effective means of genotyping, particularly when little is known about the genome or genetics of an organism.

AFLP法とは、1対の制限酵素によるゲノムDNAの消化、制限部位特異的アダプターのライゲーション、および断片サブセットのPCR増幅に関するものである。

AFLP involves digestion of genomic DNA with a pair of restriction enzymes, ligation with restriction site-specific adapters, and PCR amplification of a subset of the fragments.

■手順(Procedure)

ゲノムDNAを、EcoRIおよびMseIなど、異なる2つの制限酵素を用いて消化する。

Genomic DNA is digested with two different restriction enzymes, such as EcoRI and MseI.

制限部位特異的アダプターであるオリゴヌクレオチドを断片にライゲートする。

The fragments are ligated with restriction site-specific adapter oligonucleotides.

こうして各断片の各末端に、断片サブセットを増幅するためのPCRプライマーが認識して結合できる領域が備わる。

Each fragment now has a region on each end that can be recognized and bind PCR primers to amplify a subset of fragments.

次いで、PCRを2回連続して行い断片サブセットを選択的に増幅する。

A subset of fragments is then selectively amplified in two consecutive PCRs.

選択は、アダプターおよび認識部位に特異的にアニールし、任意に選んだ1~3個のヌクレオチドを3′末端に保持するPCRプライマーを設計することで達成される。

Selectivity is achieved by designing PCR primers that anneal specifically to the adaptor and the recognition site and carry one to three arbitrary chosen nucleotides at the 3′end.

つまり、アダプターおよび認識部位にヌクレオチドを任意に加えて伸長したものと相補的であるヌクレオチドを両末端に有する制限断片のみが増幅されることになる。

In other words, only those restriction fragments will be amplified that have on both ends nucleotides complementary to the adapter and the recognition site plus the arbitrary nucleotide extension.

PCR後、反応産物をゲル電気泳動法で分離し、それらのバンド形成パターンを解明する。

Following PCR, the reaction products are separated by gel electrophoresis and their banding patterns are resolved.